近日，瑞士苏黎世大学研究者们在《自然》发表的最新研究成果[1]，就为理解上皮细胞来源癌症的发生过程给出了重要方法和视角：研究者们开发了一种体内单细胞CRISPR测序策略，以追踪鳞状细胞癌150个突变频率最高基因在上皮组织内的克隆动力学变化，由此发现肿瘤坏死因子（TNF）信号是调控克隆扩增、促进肿瘤在早期侵袭周围组织的关键助力。

研究显示，影响上皮细胞来源癌症的TNF信号还可分为两个阶段，第一阶段即克隆扩增期的“信号源”是微环境中的巨噬细胞，但随后一部分癌细胞也会激活自分泌TNF信号，使自身具有更强的侵袭性，检测TNF或许可以在病程相对早期的阶段，发现更多上皮来源癌症，实现癌症早诊以及对患者预后的预测。

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为了实现在整个组织范围内监测克隆扩增的目标，研究者们改进了已有的CROP-seq系统（将基因盒中的嘌呤霉素换为红色荧光蛋白mCherry），并筛选了头颈鳞状细胞癌和皮肤鳞状细胞癌中最常变异的150个基因，以超声引导微注射法（使用怀孕小鼠的E9.5胚胎）构建相应的慢病毒CRISPR文库，再通过单细胞RNA测序收集所需信息。

体内单细胞CRISPR测序策略的实现过程

研究者们首先对比了小鼠出生后第4天（P4）和第60天（P60）上皮内的小向导RNA（sgRNA）富集情况，发现富集的sgRNA主要靶向NOTCH1/2家族基因及FAT、TP53突变，与既往研究[2]结论相同，这就进一步证实了体内单细胞CRISPR测序策略的可靠性。

同时研究者们发现，经筛选出的150个鳞癌常见变异基因，在上皮细胞中如果有某个单独发生变异，其导致的基因表达改变大多就与TNF信号相关，且克隆扩增速率也与TNF信号速度存在正相关性，由此可见TNF信号的影响之深。经进一步分析，这些TNF主要是由正常上皮组织中的巨噬细胞分泌的，与上皮来源鳞癌细胞表面的TNFR1受体结合，才会发挥调控作用。

但在癌症发生过程进展到肿瘤起始阶段时，TNF信号却成为了上皮来源鳞癌细胞中，强度下调最为显著的信号通路，难道它们的使命就此告一段落了吗？其实并不是，研究者们发现在这个阶段，上皮来源鳞癌细胞中仍有TNF蛋白表达，但来源却是与前面几乎完全不重合的一套“自分泌TNF基因程序”（26个基因中仅有3个重合），且主要见于一部分肿瘤特异性角质形成细胞（TSK）中。

在TSK细胞亚群中，这些自分泌来源的TNF会促进上皮-间质转化（EMT）的进展，并增强癌细胞的活动能力，使它们在肿瘤起始阶段更容易侵袭周围正常组织。最后研究者们证实，“自分泌TNF基因程序”涉及的Mmp9等基因表达水平，与人类鳞癌患者不良生存预后明确相关，因此可将这些基因作为鳞癌检测、评估预后的标志物，乃至尝试靶向治疗。

参考文献：

[1]Renz P F, Ghoshdastider U, Baghai Sain S, et al. In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution[J]. Nature, 2024.

[2]Martincorena I, Roshan A, Gerstung M, et al. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin[J]. Science, 2015, 348(6237): 880-886.